雙光子成像系統技術的原理：在強光激發下，分子同時吸收兩個光子，從基態躍遷到兩倍光子能量的激發態的過程。兩個光子可以是相同波長的，也可以是不同波長的，但必須是同時吸收（兩個光子到達被激發分子的時間間隔小于1飛秒）。可以這樣理解，先吸收一個光子的能量躍遷到一個虛擬的中間態，然后再吸收一個光子的能量躍遷到激發態。雙光子顯微鏡相對于共聚焦等其他顯微鏡的優點：~光損傷小：由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發光源，這一波段的光對活體細胞和組織的光損傷小，適用于長時間的研究；~穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題；研究表明，共聚焦熒光成像的成像深度一般在50微米左右，而雙光子顯微鏡的成像深度可達1000微米；~高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區域內可以激發出熒光，雙光子吸收僅局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內在體可傾斜雙光子顯微成像系統雙光子顯微成像系統的原理雙光子顯微成像系統如何實現。

　　•紅外激光?秒級脈沖要求–IV級別；

　　•可調鈦：藍寶?光源；

　　•?光?到達焦點同步性；

　　•能量疊加在焦點激發熒光；

　　•光?能量?以在焦點激發?個熒光事件；

　　•要求必須在?個?常?的樣本區域激發染料；

　　•?分辨率；

　　•激發和發射都需要?分辨率，因為我們要激發?個?常?的點，我們必須保持移動的點，以激發整個樣品，這是?次掃描，我們使?電動旋轉反射移動這?點，?個移動的位置在X（左/右）和?個移動位置在Y（向上/向下）下?的圖?顯?了?個簡化的相機傳感器，每個圓圈是?個敏感的像素當??個相機成像時，光是從樣品上的?個單獨的像素位點到達傳感器的，傳感器同時能讀取這個像素位點的信息但是PMT不同于相機成像，它是?個光敏感像素，并且它能分辨出光量多少我們需要將樣品分成更多的??積區域，PMT逐?讀取每個?區域?的光信息，即我們通常所說的像素PMT讀取順序；

　　•軟件將PMT采集到的這些信息重新組建成類似于?賽克?樣的圖?，我們可以很清晰的還原圖像。雙光子顯微成像系統的用途；

　　•在較厚的?物樣品中采集到較薄的光學切?熒光圖像；

　　•在體雙光?熒光成像，可在活體動物組織上實現超過300微?的成像深度，觀察感興趣神經細胞的快速3D動態變化；

　　•對于需要超?鏡下空間的實驗動物更有優勢，?如清醒?動物實驗平臺；

　　•在體可傾斜——雙光?成像物鏡可在三維平?內做任意?度的傾斜，以適應不同樣品不同成像區域的需求；

　　•雙光?成像系統可為在體電?理記錄提供圖像信息，實現對特定?標神經元的紀錄；

　　•可以與電?理記錄、動物?為測量系統相互觸發，實現同步紀錄；雙光子顯微成像系統的成像特點•在體可傾斜——雙光子成像系統可在三維平?內做任意?度的傾斜，以適應不同樣品不同成像區域的需求；

　　•三維深層掃描•掃描深度可達900微?•只激發焦點區域，光毒性?；

　　•信噪??，圖像清晰度?；

　　1.任意?度在體雙光?顯微成像系統是?套采??功率超快?秒脈沖激光器作為激發光源、在較厚的?物樣品中采集到較薄的光學切?熒光圖像的顯微鏡設備；

　　2.主要應?于在體雙光?熒光成像，可在活體動物組織上實現超過300微?的成像深度，觀察感興趣神經細胞的快速3D動態變化；

　　3.對于需要超?鏡下空間的實驗動物更有優勢，?如清醒?動物實驗平臺。雙光?成像物鏡可在三維平?內做任意?度的在體圖像，以適應不同樣品不同成像區域的需求；

　　雙光子顯微成像系統能解決的問題購買雙光子顯微成像系統的必要性

　　1.在體研究的必要性：味覺，視覺，嗅覺，聽覺，觸覺是動物所能接受的所有外部刺激，?腦就是依靠這五種感官的輸?來認知、學習與記憶整個外部世界的。?前來說,科研從invitro到invivo，多數invivo實驗是在?醉動物上實現的，如何對freelymovinganimal進?研究成了科研難點。?相對于?醉狀態下的動物來說,freelymovinganimal的動物才是?命真實的狀態,在freelymovinganimal上的實驗所得到的數據也才是可靠的數據。購買雙光子顯微成像系統的必要性。

　　2.?前科研研究現狀：我們在研究腦功能時,通常?的?法就是神經電?理的?法,?如我們想知道?腦某些特定的區域或者特定的細胞,執?什么功能,?先要設置?個合理的任務,研究動物的?為，?如曠場試驗,?迷宮實驗,?架迷宮實驗,同時我們會定量記錄?腦的電?理的活動,從?看?腦的電?理活動與這個任務是如何相關的,也就是說對?腦的電?理活動與動物?為學進?相關性分析,那我們就可以知道,動物在做某些特定?為的時候,?腦哪些細胞在放電,哪些腦區會有反應.這是?較典型的做法。由于?前在體電?理?多數是采?盲插的?式，我們看不到細胞的具體形態，如果與雙光?技術結合，我們就既可以看到細胞的放電活動，?可以觀察細胞在形態學上的特征，從?更好的研究神經細胞的功能及其特點。

　　雙光子顯微成像系統在我平臺的應用

　　1.主要應?于清醒?動物在體熒光（結構與鈣離?功能）成像，可以與本課題組??開發搭建的虛擬現實?為學平臺相結合，實現在實驗動物的?為學習過程中，對其神經環路的功能和形態的變化進??期觀察（chronicimaging）；

　　2.該系統與膜?鉗系統結合，實現雙光?成像引導下的?標膜?鉗記錄（two-photonmicroscopyguidedtargetedpatch-clamprecordings）,可以將功能成像的群體記錄（populationrecordings）與單細胞閾值下的膜電位（single-cellsubthresholdmembranepotentialrecordings）相結合，揭?神經?絡的活性是如何決定?絡中單個神經元的表征的；

　　3.該系統還配備了單細胞電穿儀（single-cellelectroporator）,可以在雙光?顯微成像的引導下，使?電轉導將外源基因導?對活體動物體內的單個細胞內，通過干涉單個細胞的基因表達，并且跟蹤觀察其結構和功能的變化，以及它對局部神經?絡的影響，研究特定細胞在?為學習、?絡調控、甚?是病程發展中的變化和作?；

　　4.與學院已建?的神經分?與細胞?物學的研究平臺相結合，將進?步拓展研究?段和研究范圍，形成從分?細胞層?，到神經環路結構功能，直?整體動物?為與功能的全?位研究體系；

　　5.實驗平臺需要滿足的條件：適合在體動物實驗?的固定載物臺式正置顯微鏡：電動Z軸，精度≦20nm，調焦?程≥25mm；電動XY軸，精度≦20nm，XY移動整體在體實驗平臺，?程≥50mm；

　　6.掃描成像模式：共振掃描與檢流計掃描混合的?式。能實現512x512像素分辨率下≥28幀/秒的成像速度。

　　雙通道PMT檢測模塊。兩個通道均配置?靈敏度GaAsPPMT檢測器，檢測模塊包含IR阻擋濾鏡、紅綠發射熒光分光濾?鏡組。為提?檢測效率，檢測器需緊靠物鏡，并且調焦時物鏡與檢測器的相對位置不變；

　　7.成像物鏡可在三維平?內做任意?度的傾斜，為保證成像穩定性，物鏡傾斜時需保持顯微鏡機?不移動。從物鏡到光學平臺的?度≥30厘?，滿?在體清醒動物雙光?實驗；

　　8.帶有壓電陶瓷型?速物鏡Z軸掃描單元，Z軸步進?程≥400微?。可配合?速XY掃描振鏡，實現?速三維VolumeScan；

　　9.進顯微鏡光路之前，激光光路中需配有普克爾盒，可實現在690-1020nm范圍內?速調節激光輸出功率的能?，且可配合?速XY振鏡使?；光路中還需配有全擋光機械快?、以及功率計（實時檢測激光功率）；

　　10.激光器峰值功率：>425kWat800nm>56kWat690nm>217kWat710nm>217kWat920nm>34kWat1040nm；

　　將要購買的雙光子顯微成像系統的優點

　　1.使?共振（resonant）掃描系統具有更快的掃描速度（30幀/秒），這是傳統的振鏡（galvo）掃描系統雙光?掃描顯微鏡掃描速度的8-10倍。

　　2.更快地掃描速率使我們能?更短的間內完成所需要的重復記錄，從?縮短單次記錄（asinglerecordingsection）的時間。

　　3.配備更加靈敏的光電探測器——磷砷化鎵光電倍增管（Galliumarsenidephosphide(GaAsP)PMT），與傳統的光電倍增管（PMT）相?，對光信號的敏感度和增益提?3-6倍，能?幅提?系統的信噪?，更重要的是讓我們能夠對光信號更弱的結構進??速成像，?如更深的?腦?層（Layer4，Layer5和Layer6）和亞細胞結構（樹突突起和軸突的末端）。

　　4.配備的激光發?器系統具有更窄脈沖寬度（<70fs）的和?散補償系統，這將?幅增強雙光?的激發效率（excitationefficiency）。在?時間（2?時）的在體成像過程中，為了避免?強度激光造成的組織損傷，?于成像的激光強度必須控制在較低的?平(20-40毫?)。

　　5.成像物鏡可在三維平?內做任意?度的傾斜，這使我們可以在保持動物頭部固定向上的姿勢的同時，對不在?平?上的腦區成像。這對清醒動物的研究很重要，因為讓動物保持相對正常的姿勢，對于探索正常的?為學習，有很?的影響。